はじめに

これまで解説してきた遺伝子改変は、多くが

• 細胞株
• 受精卵
• ex vivo操作

でした。

しかし現在の最前線は、

「体内で直接編集する」

in vivoゲノム編集です。

これは基礎研究だけでなく、
治療技術としての実装段階に入っています。

1. in vivo編集の本質的課題

最大の課題はただ一つです。

編集酵素を標的細胞にどう届けるか？

DNAを正確に切る・書き換える技術はすでに存在します。
問題は「送達（delivery）」です。

2. ウイルスベクター ― AAV

最も広く利用されているのが

Adeno-associated virus（AAV）

です。

AAVの特徴

• 病原性が低い
• 分裂しない細胞にも感染可能
• 比較的安全性が高い

特に：

• 肝臓
• 網膜
• 筋肉
• 神経

への送達に強みがあります。

制限

• 積載容量が小さい（約4.7 kb）
• Cas9が大きい
• 免疫反応の問題

このため、小型Cas9の利用や、二分割ベクター戦略が用いられています。

3. 非ウイルス系送達 ― LNP

mRNAワクチンで一躍有名になった

Lipid nanoparticle（LNP）

も重要な技術です。

LNPの特徴

• mRNAを封入可能
• 一過性発現
• 免疫原性が比較的低い
• 大量生産が可能

主に肝臓への送達効率が高いです。

4. in vivo編集の実例

現在、臨床応用が進んでいる分野：

• 遺伝性肝疾患
• 血液疾患
• 眼科疾患

特に肝臓は：

• LNPが自然に集積
• 高い編集効率
• 生検で評価可能

という理由で先行しています。

5. in vivo特有の課題

① オフターゲット

体内では全細胞を完全に解析できません。
そのため安全性評価が極めて重要です。

② モザイク

全細胞が編集されるわけではありません。
治療効果に必要な編集率が重要になります。

③ 免疫応答

• Cas9に対する既存免疫
• AAVに対する中和抗体

これらが臨床応用の大きな壁です。

6. ベースエディター・プライム編集との統合

DSBを伴わない編集技術は、

• 染色体異常リスク低減
• 安全性向上

の観点から、in vivo応用と非常に相性が良いと考えられています。

現在は、

• 小型エディター開発
• 高効率LNP改良
• 組織特異的プロモーター利用

が活発に研究されています。

7. 概念的転換点

in vivoゲノム編集は、

「モデル作製技術」から「治療技術」への転換

を意味します。

これは分子生物学の枠を超え、

• 臨床医学
• 薬学
• 倫理学
• 社会制度

と密接に関わる段階に入ったことを示します。

まとめ

in vivo遺伝子改変の鍵は：

• 送達技術
• 安全性
• 効率

技術的ブレイクスルーはすでに起きていますが、
実装には慎重な検証が不可欠です。

はじめに

従来のCRISPR-Cas9は「切って修復させる」技術でした。

しかしDNA二本鎖切断（DSB）には、

• 予測不能なindel
• 染色体転座
• p53活性化

といったリスクがあります。

そこで登場したのが、

DNAを切らずに書き換える技術です。

1. ベースエディター（Base Editor）

ベースエディターは、

• Cas9ニッカーゼ（nCas9）
• 脱アミノ化酵素

を融合した人工タンパク質です。

Cas9は片鎖のみを切断し、
脱アミノ化酵素が塩基を化学的に変換します。

① CBE（Cytosine Base Editor）

C → T 変換を誘導

仕組み：

C → U（脱アミノ化）
修復過程で U → T に固定

② ABE（Adenine Base Editor）

A → G 変換を誘導

A → I（イノシン）
IはGとして認識される

ベースエディターの特徴

• DSBを伴わない
• HDR不要
• 効率が高い
• ただし変換可能な塩基が限定される

ヒト疾患変異の約半数は点変異であるため、
非常に大きな臨床的ポテンシャルがあります。

2. プライムエディティング（Prime Editing）

より柔軟な編集を可能にしたのが

Prime editing

です。

開発者は David Liu ら。

仕組み

構成要素：

• nCas9
• 逆転写酵素（RT）
• pegRNA（拡張ガイドRNA）

pegRNAは：

• 標的配列指定
• 書き換え配列情報
• RTテンプレート

を同時に含みます。

編集の流れ

1. nCas9が片鎖切断
2. pegRNAを鋳型に逆転写
3. 新配列がゲノムに組み込まれる
4. 修復により固定

これにより、

• 塩基置換
• 小規模挿入
• 小規模欠失

が可能になります。

3. ベースエディター vs プライムエディティング

4. なぜ「切らない」ことが重要か？

DSBは細胞にとって強いストレスです。

• p53活性化
• 大規模欠失
• 予期せぬ染色体再構成

特に臨床応用では、安全性が最重要です。

切らない編集は、

精密医療への橋渡し技術

といえます。

5. 限界と課題

ベースエディター

• 編集ウィンドウ制限
• バイスタンダー変異

プライム編集

• 効率が細胞種依存
• in vivo応用は発展途上

現在は送達技術（AAV, LNPなど）との統合が研究されています。

6. 概念的意義

従来のゲノム編集は

「壊す技術」

でした。

一方、これらの技術は

「精密に修復する技術」

です。

これは医学的にも哲学的にも大きな転換点です。

まとめ

ベースエディターとプライムエディティングは：

• DSB不要
• 精密な点変異導入が可能
• 臨床応用に近い

次世代ゲノム編集の中心技術です。

はじめに

通常のノックアウトでは、

• 胎生致死
• 全身性影響
• 発生段階での補償

といった問題が生じます。

そこで開発されたのが
「時間」と「空間」を制御できる遺伝子改変技術です。

その中心が Cre-loxP system です。

1. Cre-loxPシステムの基本原理

この技術は、バクテリオファージP1由来の組換え酵素 Cre を利用します。

基本構造

• loxP配列（34 bp）
• Creリコンビナーゼ

遺伝子の重要エクソンを2つのloxPで挟みます。

これを「flox（flanked by loxP）」と呼びます。

Creが発現すると：

loxP間が切り取られる（excison）

これにより特定遺伝子が削除されます。

2. 組織特異的ノックアウト

Creを特定プロモーターの下で発現させることで、

• 肝臓だけ
• 神経だけ
• 免疫細胞だけ

といった組織特異的ノックアウトが可能になります。

例

• Albumin-Cre（肝臓）
• Nestin-Cre（神経系）
• Lck-Cre（T細胞）

これにより、

「その組織での機能」だけを解析できる

ようになりました。

3. 時間特異的制御 ― 誘導型Cre

発生段階での影響を避けたい場合は、
誘導型Creを用います。

代表例：

Cre-ERT2

Creにエストロゲン受容体変異体を融合。

通常は細胞質に存在し、

タモキシフェン投与により核へ移行 → 組換えが起こる。

つまり：

投与タイミング＝遺伝子削除タイミング

となります。

4. 実験設計で重要なポイント

① flox設計

• 共通エクソンを挟む
• フレームシフトを確実に起こす
• 代替スプライシング回避

② Creの発現パターン検証

• レポーターマウスとの交配
• Rosa26-LSL-tdTomatoなど

Creの発現漏れ（leakiness）確認は必須です。

③ ヘテロとホモの違い

多くの場合：

• flox/flox
• Cre+

の個体でKOが起きます。

コントロール設計が非常に重要です。

5. よくある落とし穴

❌ Cre自体の毒性

Cre発現のみで表現型が出ることがあります。

❌ 不完全な削除

全細胞で完全KOになるとは限りません。

❌ 補償機構

発生段階での適応が生じる場合があります。

6. CRISPRとの統合

現在は、

• CRISPRでfloxアレルを作製
• 既存Creラインと交配

という流れが一般的です。

これにより、従来より迅速にコンディショナルマウスを作製可能になりました。

7. 概念的な意義

コンディショナル改変は単なる技術ではありません。

それは、

• 遺伝子機能の「文脈依存性」
• 組織間相互作用
• 時間軸による役割変化

を解析するための方法論です。

発生とがん、生理と病態を切り分ける上で不可欠です。

まとめ

コンディショナル遺伝子改変の本質は：

• loxPで挟む
• Creで切る
• 発現場所とタイミングを制御する

この3点に集約されます。

全身KOでは見えなかった機能が、
時間・空間を制御することで初めて明らかになります。

はじめに

CRISPR-Cas9の原理を理解しても、
実験は「どう設計するか」で結果が決まります。

今回は、ノックアウト（KO） と ノックイン（KI） をどのように戦略的に設計するかを、研究現場の視点で整理します。

1. ノックアウト設計の基本戦略

① どのエクソンを狙うか？

最重要ポイントは：

できるだけ上流の共通エクソンを狙う

理由：

• フレームシフトが起これば、ほぼ確実に機能喪失
• ナンセンス変異によるNMD誘導
• 代替スプライシング回避

避けるべき設計

• 末端エクソンのみを標的にする
• 機能ドメイン外のみを切断する

② 1本gRNAか2本gRNAか？

● 1本gRNA（indel誘導）

• 最も簡便
• 小さな挿入欠失を利用
• スクリーニングが必要

● 2本gRNA（エクソン欠失）

• 狙った領域を確実に削除
• PCRで検出容易
• 大きな欠失を誘導可能

研究目的によって使い分けます。

③ フレームシフト確認は必須

• Sangerシーケンス
• TIDE解析
• ICE解析

タンパクレベルでは：

• Western blot
• FACS
• 機能アッセイ

「DNAが変わった」＝「機能が失われた」ではありません。

2. ノックイン設計の基本戦略

ノックインはHDR依存です。

① 挿入目的を明確にする

• レポーター導入（GFP, tdTomatoなど）
• タグ付加（FLAG, HA）
• 点変異導入
• 条件付きアレル作製

目的によってテンプレート設計が全く異なります。

② HDRテンプレート設計

重要要素：

• 相同アーム（通常500–1000 bp）
• 切断部位から近い変異導入
• PAM変異導入（再切断防止）

PAMを変えないと、編集後も再び切られます。

③ テンプレートの形式

大型ノックインでは効率が大きな課題になります。

3. 実験系ごとの戦略の違い

① 細胞株

• HDR効率が比較的高い
• クローン選別が可能
• モザイクは問題にならない

② マウス受精卵

• モザイク問題あり
• HDR効率が低い
• founder解析が重要

③ in vivo直接編集

• ウイルスベクター利用
• オフターゲット管理が重要
• 組織特異性が課題

4. よくある失敗パターン

❌ フレームがずれないin-frame変異

→ 機能が残る

❌ 代替スプライシングが発生

→ 予想外のタンパク産生

❌ HDRが起こらない

→ NHEJ優位

❌ モザイク

→ 個体差が大きい

5. 戦略設計の思考フレーム

実験設計は以下の順序で考えます：

1. 仮説は何か？
2. 機能喪失で十分か？
3. レポーターは必要か？
4. 時間軸制御は必要か？
5. 組織特異性は必要か？

単に「遺伝子を壊す」ではなく、
何を証明したいかから逆算することが最重要です。

6. 概念的に重要な点

遺伝子改変は因果関係を証明する最強の方法ですが、

• 補償経路
• 遺伝子冗長性
• 環境依存性

によって、表現型が見えないこともあります。

つまり、

表現型が出ない＝機能がない
ではありません。

まとめ

ノックアウトとノックイン設計の本質は：

• 分子生物学的構造理解
• DNA修復機構の理解
• 仮説駆動型の設計

CRISPRは簡単ですが、
良い実験設計は決して簡単ではありません。

はじめに

前回は、遺伝子改変技術の全体像を概観しました。
今回は、現代の遺伝子改変を一変させた CRISPR-Cas9 の分子メカニズムを詳しく解説します。

この技術はなぜこれほど簡単で、正確で、強力なのでしょうか？

1. CRISPRとは何か？

CRISPRはもともと細菌が持つ「獲得免疫システム」です。

ウイルス感染を受けた細菌は、そのウイルスDNAの一部を自分のゲノムに取り込み、再感染時にそれを目印としてウイルスを切断します。

この仕組みを人工的に利用したのが

CRISPR-Cas9

です。

2. 基本構成要素

CRISPR-Cas9は、たった2つの要素で機能します。

① Cas9タンパク質

DNAを切断する“分子ハサミ”。

② ガイドRNA（gRNA）

切断位置を指定する“GPS”。

ガイドRNAは約20塩基の配列を持ち、標的DNAと相補的に結合します。

この「配列相補性」こそが、従来技術と決定的に異なる点です。

3. PAM配列 ― 切断の絶対条件

Cas9がDNAを切るには、標的配列の隣に特定の短い配列が必要です。

これを PAM（Protospacer Adjacent Motif） と呼びます。

代表的なCas9（SpCas9）では：

5′-NGG-3′

という配列が必要です。

PAMがない場所は、どれほどガイドRNAが一致していても切断できません。

4. DNA切断の仕組み

Cas9はDNAを二本鎖同時に切断します。

内部には2つのヌクレアーゼドメインがあります：

• RuvCドメイン
• HNHドメイン

それぞれがDNAの片鎖を切断し、二本鎖切断（DSB） が生じます。

ここからがゲノム編集の本質です。

5. DNA修復経路が編集を決める

DNAが切断されると、細胞は必ず修復を行います。

主な修復経路は2つです。

① NHEJ（非相同末端結合）

• テンプレート不要
• エラーが入りやすい
• 挿入・欠失（indel）が生じる

→ フレームシフトを起こしやすい
→ ノックアウトに利用

② HDR（相同組換え修復）

• 相同DNAテンプレートが必要
• 正確な修復が可能
• S/G2期で活性が高い

→ 外来配列の挿入が可能
→ ノックインに利用

6. なぜCRISPRは革命的だったのか？

従来技術（ZFNやTALEN）は：

• タンパク質を毎回設計する必要があった
• 作製が複雑
• コストが高い

一方、CRISPRでは：

• 設計変更はRNA配列のみ
• 合成が簡単
• 多重編集が可能

このシンプルさが、世界中の研究室で爆発的に普及した理由です。

7. 応用拡張技術

CRISPRは現在も進化しています。

dCas9（切らないCas9）

転写制御に利用可能（CRISPRi / CRISPRa）

ベースエディター

DNAを切断せずに塩基変換

プライムエディティング

より精密な配列書き換え

これらは今後の回で詳しく解説します。

8. 注意点と限界

CRISPRにも課題があります。

• オフターゲット切断
• HDR効率の低さ
• モザイク変異
• in vivo送達の難しさ

現在の研究は、「精度」と「安全性」の向上に向かっています。

まとめ

CRISPR-Cas9の本質は：

1. 配列相補性で標的を指定
2. Cas9が二本鎖切断
3. 細胞のDNA修復機構を利用して編集

という極めて合理的な仕組みです。

この技術により、遺伝子改変は「特殊技術」から「日常的ツール」へと変わりました。

はじめに

生命は「設計図」であるDNAに基づいて成り立っています。
もしその設計図を書き換えることができたら——。

遺伝子改変技術は、この問いに真正面から答えてきた科学の歩みです。現在では、基礎研究のみならず、医療・創薬・農業・再生医療にまで広がる巨大な分野へと発展しています。

本シリーズでは、遺伝子改変技術の原理から応用、そして未来までを体系的に解説していきます。

第1回では、その全体像と歴史的背景を整理します。

1. 遺伝子改変技術とは何か？

遺伝子改変技術とは、DNA配列を人為的に操作する技術の総称です。

主な操作は以下の3つです：

• 遺伝子を「入れる」（ノックイン）
• 遺伝子を「壊す」（ノックアウト）
• 遺伝子を「書き換える」（点変異導入・編集）

この技術により、特定の遺伝子の機能を解析したり、疾患モデル動物を作製したりすることが可能になります。

2. 組換えDNA技術の誕生

遺伝子改変の始まりは1970年代。

制限酵素とDNAリガーゼの発見により、DNAを「切ってつなぐ」ことが可能になりました。これが組換えDNA技術です。

この技術を基盤に、インスリンや成長ホルモンといった医薬品が微生物で大量生産されるようになりました。

1980年代には、トランスジェニックマウスの作製が可能となり、遺伝子機能解析は飛躍的に進みます。

3. ノックアウトマウスの時代

1989年、相同組換えを利用した遺伝子標的化技術が確立されました。

代表的研究者：

• Mario Capecchi
• Martin Evans
• Oliver Smithies

彼らはこの功績により2007年にノーベル生理学・医学賞を受賞しました。

この技術では、ES細胞を用いて特定遺伝子を欠損させたマウス（ノックアウトマウス）を作製します。
これにより、「遺伝子Aが無いと何が起こるか」を直接検証できるようになりました。

しかし、この方法は：

• 時間がかかる（1年以上）
• 技術的に難易度が高い
• 費用が高い

という制限がありました。

4. ゲノム編集革命 ― CRISPRの登場

2012年、状況は一変します。

Jennifer Doudna と Emmanuelle Charpentier によって開発された CRISPR-Cas9 は、DNAを狙った場所で簡便に切断できる画期的技術でした。

その特徴は：

• 設計が容易
• 効率が高い
• 多くの生物種で利用可能
• コストが低い

この技術により、ゲノム編集は一部の専門施設だけでなく、世界中の研究室で日常的に行える技術へと変わりました。

2020年にはノーベル化学賞が授与されています。

5. 現在の遺伝子改変技術の分類

現在、遺伝子改変技術は大きく3世代に分類できます。

第1世代：組換えDNA技術

• プラスミドクローニング
• トランスジェニック動物

第2世代：相同組換え

• ノックアウトマウス
• コンディショナルKO

第3世代：ゲノム編集技術

• CRISPR-Cas9
• ベースエディター
• プライムエディティング

今後の回で、それぞれの分子メカニズムを詳細に解説していきます。

6. 遺伝子改変技術がもたらしたパラダイムシフト

遺伝子改変技術は、単なる実験手法ではありません。

それは、

• 因果関係を直接証明できる手段
• 疾患モデルを人工的に再現できる方法
• 治療標的を検証する最強のツール

となりました。

特にがん研究や幹細胞研究では、「遺伝子を操作して機能を証明する」ことがスタンダードになっています。