はじめに
蛍光タンパクは「光るレポーター」としてだけでなく、タンパク質が細胞内のどこで機能しているのかを直接可視化できる強力なツールです。本回では、GFPなどの蛍光タンパクを目的タンパクに融合することで行う細胞内局在解析の基本的な考え方と、実験デザイン上の重要な注意点を解説します。
1. なぜ局在解析が重要なのか
タンパク質の機能は、その発現量だけでなく**細胞内の「場所」**によって大きく規定されます。
- 核内に存在すれば転写制御因子の可能性
- 細胞膜に局在すれば受容体や接着分子
- ミトコンドリア局在なら代謝・アポトーシス制御
蛍光タンパク融合体を用いることで、
- 固定標本に頼らず
- 抗体染色なしで
- 生細胞のまま
局在を観察できる点が大きな利点です。
2. 蛍光タンパク融合の基本構造
一般的な融合タンパクは以下の構造をとります。
- N末端融合：GFP–目的タンパク
- C末端融合：目的タンパク–GFP
どちらを選ぶかは非常に重要で、
- シグナルペプチド
- 膜貫通領域
- 核移行シグナル（NLS）
などがN末端またはC末端に存在する場合、蛍光タンパクを付加することで局在や機能が破綻することがあります。
👉 原則として、両方の融合体を作製し比較することが推奨されます。
3. リンカー配列の役割
蛍光タンパクと目的タンパクの間には、しばしばリンカー配列が挿入されます。
- 柔軟性を持たせる
- 立体障害を軽減する
- 正常なフォールディングを促す
代表的なリンカーは以下です。
- (Gly–Gly–Gly–Gly–Ser)n
リンカーの有無で局在が変わるケースもあり、意外に重要な設計要素です。
4. 内在性タンパク vs 過剰発現系
蛍光融合タンパク解析には大きく2つのアプローチがあります。
過剰発現系
- プラスミド導入が容易
- シグナルが強い
- ただし非生理的局在を示すリスクあり
内在性ノックイン
- CRISPR/Cas9によるGFPノックイン
- 生理的発現量を反映
- 技術的ハードルは高いが信頼性が高い
近年の論文では、内在性タグ付けが強く推奨される傾向にあります。
5. 局在解析でよくある落とし穴
- 凝集体形成（明るすぎるドット）
- ERストレスによる誤局在
- 蛍光タンパク自体の二量体化
そのため、
- 複数細胞での再現性確認
- 抗体染色との比較
- 機能アッセイによる検証
を組み合わせることが重要です。
まとめ
- 蛍光タンパク融合は細胞内局在解析の基本技術
- N末端／C末端、リンカー設計が結果を左右する
- 過剰発現の解釈には注意が必要
- 可能であれば内在性ノックインが理想
次回は、これらの融合タンパクを用いたライブセルイメージングについて詳しく解説します。