はじめに
次世代シーケンサー（Next Generation Sequencing：NGS）は、ゲノムやトランスクリプトームの網羅的な解析を可能にした革新的な技術です。特にRNA-seqやDNA-seqでは、「シーケンス」「マッピング」「定量解析」の3ステップが基本的な解析フローとなります。
この記事では、それぞれのステップについて、バイオインフォマティクス初心者でも理解できるように、丁寧に解説します。
ステップ①：シーケンス（Sequencing）
目的：
DNAやRNA由来の断片を読み取り、**塩基配列（リード）**として取得する。
概要：
NGSでは、まずライブラリ化されたDNA断片（アダプターが付いた状態）をシーケンサーで読み取ります。代表的なプラットフォームとしてIllumina（短鎖リード）やOxford Nanopore（長鎖リード）があります。
流れ：
- ライブラリ調製：断片化 → アダプター付加 → 増幅
- クラスター生成（Illumina）：フローセル上で同一DNA断片が増幅される
- シーケンシング：
- Illumina：リバーシブルターミネータ法
- Nanopore：ナノポアを通過する電流変化で塩基を読み取る
- FASTQファイル出力：リード配列とクオリティ情報が含まれる
ステップ②：マッピング（Mapping）
目的：
得られたリードを、**既知のリファレンスゲノムやトランスクリプトームに位置づける（アラインメント）**こと。
使用ツール：
- DNA-seq：BWA, Bowtie2
- RNA-seq：STAR, HISAT2 など（スプライスサイトの処理も対応）
ポイント：
- リード品質の確認（FastQCなど）
- トリミング（低品質な塩基やアダプター除去）
- マルチマッピング：同じリードが複数の場所に当たる場合の処理
- 出力形式：SAM/BAMファイルとして保存
補足：
RNA-seqでは、スプライシングを考慮したアラインメントが重要です。例えば、STARはイントロンをスキップしてエクソンをつなぐリードにも対応できます。
ステップ③：定量解析（Quantification）
目的：
遺伝子やトランスクリプトの発現量を定量化する。
方法：
- カウントベース法：
- featureCounts（遺伝子ごとのリード数をカウント）
- HTSeq-count
- 確率モデルベース：
- RSEM, Salmon, Kallisto（高速でトランスクリプトレベルの定量が可能）
正規化の重要性：
- TPM（Transcripts Per Million）
- FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million reads mapped）
- DESeq2やedgeRでは、生データからライブラリサイズ補正を加味
応用解析への発展
定量解析後は、差次的発現解析（DEG解析）、クラスタリング、経路解析、Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）などに進むのが一般的です。
まとめ
| ステップ | 内容 | 主なツール | 出力 |
|---|---|---|---|
| シーケンス | 塩基配列を読む | Illumina, Nanopore | FASTQ |
| マッピング | リードをゲノムに配置 | STAR, HISAT2 | BAM |
| 定量解析 | 発現量の計算 | featureCounts, Salmon | カウント行列（TSVなど） |
NGS解析は一見複雑ですが、上記の3ステップを理解することで、解析の全体像がつかめます。今後、RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seqなど、さまざまなオミクス解析にも応用可能です。