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空間オミックスは「データ解析が大変」という印象が強いですが、実際に最も失敗が多いのは実験の前処理段階です。
RNA品質、組織の固定条件、透過処理、逆転写条件——これらはいずれも空間情報の忠実度に直結します。

本記事では、Visium と Slide-seq をモデルケースとして、実験全体の流れと重要ポイントを詳しくまとめます。

1. 全体フローの俯瞰図

空間オミックスは、基本的に以下の 4 ステップで進みます。

1. 組織の前処理（固定・凍結・切片作製）
2. スライドへの貼り付け → 透過処理 → 逆転写
3. ライブラリ作製（空間バーコード付き）
4. シーケンス → 画像とのアラインメント → カウント行列化

Visium と Slide-seq は計測原理が異なりますが、本質的な流れは同じです。

2. 組織前処理：最も結果を左右するステップ

2-1. 凍結 vs FFPE：RNA品質は凍結が圧倒的に有利

• 凍結（Fresh-frozen）
  • 利点：RNAが良好、遺伝子網羅性が高い
  • 欠点：形態保持が難しい、クライオセクション技術が必要
• FFPE
  • 利点：臨床検体で普及、形態が安定
  • 欠点：RNA断片化 → 特にキャプチャ型では網羅性低下
  • Visium FFPE, CosMx, Xenium のように FFPE対応プラットフォームは増加中

研究目的が“網羅的な発現”であれば、可能な限り凍結を推奨します。

2-2. 切片作製（5–10 μmが標準）

• Visium：10 μmが一般的
• Slide-seq：10 μm
• イメージング型（MERFISH など）：通常 5–10 μm

失敗例：切片が厚すぎる

→ mRNAがプローブや基板に届かず、キャプチャ効率が下がる。

失敗例：切片が薄すぎる

→ 組織の形態が崩れ、細胞境界が不明瞭になる。

2-3. 組織固定・染色（H&E が標準）

• Visium：
  • 染色前の methanol fixation が標準
• Slide-seq：
  • 凍結切片をビーズ表面に貼りつけ
  • その後、methanol 固定 → 透過処理（permeabilization）

染色画像は後のアラインメント・セグメンテーションに必須なので、明瞭な H&E 画像を確保することが極めて重要です。

3. 透過処理（Permeabilization）：成功の“分岐点”

細胞膜を壊して mRNA を取り出す工程ですが、
“過剰処理”と“処理不足”が直接ライブラリ品質に反映されます。

3-1. Visium の場合

• スライド上に各組織で最適な透過時間があり、**Time course assay（最適化キット）**で決定する
• 透過が不十分 → キャプチャされる mRNA が少ない
• 透過しすぎ → RNA が拡散し、空間解像度が損なわれる

最適化せずに本番実験を行うと、スポット毎の UMI が極端に低くなる事故が非常に多いです。

3-2. Slide-seq の場合

• マイクロビーズ表面のオリゴで mRNA を捕まえるため
  透過工程の効率＝ビーズ再構成クオリティに直結
• 透過不足 → RNA 回収量が激減
• 透過過剰 → RNA が近隣ビーズに広がり“空間ブレ”が発生

Slide-seq は Visium と比べても“工程依存性が強い”ため、熟練者のプロトコールが事実上の標準になっています。

4. 逆転写・ライブラリ作製

4-1. 空間バーコードの取り込み

• Visium：スポットごとにユニークバーコード
• Slide-seq：ビーズごとのバーコード（後で座標を再構築）
• RNA → cDNA → PCR → ライブラリ準備

逆転写効率は
RNA品質 × 透過条件 × 酵素の効率で決まります。

典型的なQC指標

• ライブラリサイズ分布（Bioanalyzer）
• PCRサイクル数
• cDNAの総量
• Spike-in の比率

5. シーケンス条件（読長・深度）

5-1. Visium

• PE 100–150 bp
• 1スライドあたり3–6億リードが推奨
• 深度が浅いとスポットの発現が sparse になり、細胞型推定精度が落下

5-2. Slide-seq / Slide-seqV2

• より高解像度（ビーズスケール）のため、Visiumより深度が必要
• 1スライド 5–10 億リードが一般的
• 実際には「深いほど良い」と言われる領域

6. 画像とのアラインメント（空間情報の回復）

6-1. Visium の場合

• H&E 画像を取得
• スポット配置は固定なので、
  Space Rangerが自動で位置合わせ
• 正確なアラインメントは、細胞型投影の品質に直結

6-2. Slide-seq の場合（最大の特徴）

• ビーズアレイをまず画像として取得 → 座標再構成が必要
• Decode（ビーズバーコードの位置決定）→ マッピング
• この reconstruction が精度低いと、すべての解析の精度が落ちる

Slide-seq の成功率は、この工程が 7〜8割を占めると言って過言ではありません。

7. カウント行列（gene × spot/bead）の生成

完成したデータは、最終的に

• Visium：スポット × 遺伝子
• Slide-seq：ビーズ × 遺伝子

のマトリクスとして出力されます。

この段階ではまだ“解析可能な空間データ”の入口にすぎません。
次回（第5回）はここから、

• scRNA-seqとの統合
• セルタイプ推定
• デコンボリューション
• ノイズフィルタリング
• 正規化と空間平滑化

といった解析パイプラインを詳しく扱います。

まとめ

• 空間オミックスの成功の8割は、前処理（試料・切片・透過）が支配
• Visiumは“スポット固定”、Slide-seqは“ビーズ再構築”が鍵
• シーケンス深度は十分に確保すべき（浅いと解析不能）
• 画像アラインメントは空間解析の基礎になる