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分子生物学は今や「見る科学」から「操る科学」へと進化しています。第9章では、生命現象を理解・改変するための遺伝子工学とオミクス技術について学びます。

遺伝子工学：DNAを切って貼って操る技術

遺伝子工学は、DNAを精密に操作して目的のタンパク質を発現させたり、遺伝子の機能を解析したりする技術です。

DNAクローニング

DNA断片をベクター（プラスミドなど）に組み込み、細胞内で増やす手法です。制限酵素とDNAリガーゼを用いる古典的な方法から、近年ではGibson AssemblyやGolden Gate Assemblyといった高効率な方法も登場しています。

PCR：DNAのコピー機

Polymerase Chain Reaction（PCR）は、特定のDNA配列を指数関数的に増幅する技術です。実験の入り口でもあり、ゲノム解析、診断、遺伝子導入など多くの応用に使われています。

CRISPR-Cas9：ゲノム編集の革命

今もっとも注目されている遺伝子工学技術が、CRISPR-Cas9システムです。これはバクテリア由来の防御機構を応用したもので、狙ったDNA配列を正確に切断・修復できるため、ノックアウトやノックインが容易に行えます。今後の医療や農業、基礎研究のブレイクスルーとなる可能性を秘めています。

オミクス技術：網羅的に見る生命システム

「オミクス（-omics）」とは、ある生体分子の全体像を一括して捉えるアプローチを指します。これは細胞や生物の全体像を一枚のスナップショットとして捉える技術群とも言えます。

ゲノミクス（Genomics）

ゲノム（全DNA配列）を網羅的に解析します。次世代シーケンシング（NGS）技術により、1人のゲノム全体を数日で読むことが可能になりました。ヒトゲノム計画では10年かかっていた解析が、今ではラボで日常的に行える時代です。

トランスクリプトミクス（Transcriptomics）

RNA（主にmRNA）の発現状態を網羅的に解析する技術です。代表的なのが**RNA-seq（RNAシーク）**で、発現量の定量だけでなく、スプライシングバリアントや融合遺伝子の検出も可能です。

単一細胞レベルのscRNA-seqも登場し、細胞の多様性や分化過程を高解像度で追跡できるようになりました。

プロテオミクス（Proteomics）

mRNAの発現だけでは実際の細胞機能は予測できません。そこで重要になるのがタンパク質の網羅的解析です。質量分析（MS）を用いて、**タンパク質の種類、発現量、翻訳後修飾（リン酸化など）**まで解析できます。

メタボロミクス（Metabolomics）

細胞内の代謝物（低分子）を網羅的に解析する分野です。プロテオミクスと合わせることで、生命活動の最終的なアウトプット（代謝変化）まで捉えることができます。

技術の融合と未来

これらの技術は単独でも強力ですが、ゲノミクス×トランスクリプトミクス×プロテオミクス×メタボロミクスといった多層的なデータの統合により、**生命現象をシステムとして理解する「システム生物学」**へと進化しています。

また、AIやビッグデータ解析と組み合わせることで、新たな発見の創出や創薬、個別化医療、人工生命設計などへの応用が進んでいます。

まとめ

遺伝子工学とオミクス技術は、現代の生物学・生命科学を根本から変えました。
もはや単なる観察ではなく、「設計し、操作し、予測する」時代が到来しています。

これらの技術を正しく理解し、実験デザインに組み込むことで、分子レベルから細胞、個体、集団に至るまで、生命の謎に迫ることが可能になります。

はじめに：SeuratとScanpyとは？

• Seurat：R言語ベースのシングルセルRNA-seq解析パッケージ。豊富な可視化と柔軟なクラスタリング機能が特徴。
• Scanpy：Pythonベースで高速処理が得意。大規模データ解析や自動化に向く。

両者は解析の目的や使用環境に応じて使い分けられます。

【共通】解析ワークフローの全体像

1. データ読み込み
2. 前処理（フィルタリング、正規化、スケーリング）
3. 次元圧縮（PCA, UMAP, t-SNE）
4. クラスタリング
5. マーカー遺伝子の抽出
6. 注釈（細胞タイプの同定）
7. 差次的発現解析（DEG）
8. 可視化

Seurat（R）の解析手順（例：10xデータ）

rコピーする編集するlibrary(Seurat)

# 1. データ読み込み
data <- Read10X(data.dir = "path/to/data")
seurat_obj <- CreateSeuratObject(counts = data)

# 2. 前処理
seurat_obj <- subset(seurat_obj, subset = nFeature_RNA > 200 & percent.mt < 5)
seurat_obj <- NormalizeData(seurat_obj)
seurat_obj <- FindVariableFeatures(seurat_obj)

# 3. 次元圧縮とクラスタリング
seurat_obj <- ScaleData(seurat_obj)
seurat_obj <- RunPCA(seurat_obj)
seurat_obj <- FindNeighbors(seurat_obj, dims = 1:10)
seurat_obj <- FindClusters(seurat_obj, resolution = 0.5)
seurat_obj <- RunUMAP(seurat_obj, dims = 1:10)

# 4. 可視化
DimPlot(seurat_obj, reduction = "umap", label = TRUE)

# 5. マーカー遺伝子と注釈
markers <- FindAllMarkers(seurat_obj)

Scanpy（Python）の解析手順（例：h5ファイル）

pythonコピーする編集するimport scanpy as sc

# 1. データ読み込み
adata = sc.read_10x_h5("path/to/data.h5")

# 2. 前処理
sc.pp.filter_cells(adata, min_genes=200)
sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=3)
adata.var['mt'] = adata.var_names.str.startswith('MT-')
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, inplace=True)
adata = adata[adata.obs.pct_counts_mt < 5, :]

sc.pp.normalize_total(adata)
sc.pp.log1p(adata)
sc.pp.highly_variable_genes(adata, n_top_genes=2000)
adata = adata[:, adata.var.highly_variable]

# 3. 次元圧縮とクラスタリング
sc.pp.scale(adata)
sc.tl.pca(adata)
sc.pp.neighbors(adata)
sc.tl.umap(adata)
sc.tl.leiden(adata)

# 4. 可視化
sc.pl.umap(adata, color=['leiden'])

# 5. マーカー遺伝子
sc.tl.rank_genes_groups(adata, 'leiden', method='t-test')
sc.pl.rank_genes_groups(adata, n_genes=10)

Seurat vs Scanpy：どっちがオススメ？

まとめ：まずは使いやすい方から始めよう！

• 少数～中規模データで直感的に解析したい人 → Seurat
• Pythonが得意で大規模データや自動化を視野に入れたい人 → Scanpy

どちらも無料でドキュメントが豊富なので、まずはチュートリアルを動かしながら覚えていくのが最短ルートです！

はじめに：なぜscRNA-seqには複数の手法があるのか？

シングルセルRNA-seqは、1細胞ごとの遺伝子発現プロファイルを解析するための強力な技術です。
しかしその目的（例：大量の細胞をざっくり見る vs 少数細胞を高精度で解析）や、使用する機器、予算によって最適な手法が異なります。
そのため、現在では複数のscRNA-seq法が存在しています。

本記事では代表的な以下3手法を比較します：

• 10x Genomics Chromium（ドロップレット法）
• Smart-seq2（プレート法）
• Drop-seq（ドロップレット法）

比較表：scRNA-seq主要法の特徴一覧

それぞれの技術の解説

1. 10x Genomics Chromium：業界標準のハイパフォーマンス技術

• 仕組み：1細胞とバーコード付きビーズを油滴（ドロップレット）内で一緒に閉じ込め、cDNAを合成。
• 特徴：
  • 一度に数万細胞を処理可能
  • 高スループットで操作も簡便（専用機器が必要）
  • 3’ or 5’ 末端を検出するライブラリ構築が可能
  • クローズドシステムだが再現性・精度は非常に高い
• おすすめ：網羅的な細胞タイプの分類・クラスタリング解析

2. Smart-seq2：全長トランスクリプトを高精度で取得

• 仕組み：1細胞を96 or 384ウェルプレートに分注し、mRNAを逆転写・PCR増幅。全長cDNAを得る。
• 特徴：
  • 非常に高感度・高精度（全長mRNA検出可能）
  • SNP解析やアイソフォーム解析にも対応
  • 自由度が高く、特殊な遺伝子を狙いやすい
• 欠点：UMIがないため定量性はやや劣る
• おすすめ：希少細胞（幹細胞など）の詳細発現解析、遺伝子構造の変化解析

3. Drop-seq：コスパ重視のオープンソース技術

• 仕組み：1細胞とバーコード付きビーズを油滴内で閉じ込める。10xと似ているがオープンなシステム。
• 特徴：
  • 低コストで大量細胞の解析が可能
  • 自作装置が必要だが、自由度が高い
  • 3’末端しか検出できないため一部の解析には不向き
• おすすめ：大規模スクリーニングや自作システムでの低予算研究

まとめ：どのscRNA-seq法を使うべき？

はじめに：RT-qPCRって何？

RT-qPCR（アールティー・キューピーシーアール）とは、

「RNAをDNAに変換し、それをリアルタイムで定量するPCR」

のことです。
正式には「Reverse Transcription quantitative PCR（逆転写定量PCR）」と呼ばれ、RNAの量を正確に測るために使われています。

どういうときにRT-qPCRを使うの？

• ウイルスRNA（例：新型コロナウイルス）を検出
• 細胞の**遺伝子発現量（mRNA）**を調べる
• 遺伝子治療や創薬の効果検証など、医療・バイオ研究の必須技術

RNAはそのままではPCRできないため、まずDNA（cDNA）に変換してからPCRを行うのがポイントです。

RT-qPCRの基本ステップ

RT-qPCRは、以下の2段階の反応で行われます：

① 逆転写（RT：Reverse Transcription）

RNAからDNA（cDNA）を作るステップ
→ 酵素「逆転写酵素（リバーストランスクリプターゼ）」を使用

② qPCR（リアルタイムPCR）

cDNAを蛍光を使ってリアルタイムに増幅・定量するステップ
→ 蛍光色素（SYBR Green）やプローブ（TaqMan）を使用

RNA → cDNA → DNAをリアルタイムで測定！

RNA（例：mRNA）
　↓ 逆転写（RT）
cDNA（一本鎖のDNA）
　↓ qPCR
定量（Ct値で評価）

RNAの量が多いほど、できるcDNAも多くなり、qPCRでのCt値は小さくなります。

Ct値（Cycle threshold）とは？

qPCRと同様に、RT-qPCRでもCt値が重要です。これは、

「蛍光が検出され始めるサイクル数」

のことで、Ct値が小さいほど、もともとのRNA量が多かったことを意味します。

RT-qPCRでよく使う試薬と装置

• 逆転写酵素（例：SuperScript, ReverTra Aceなど）
• SYBR Green：DNAに結合して蛍光を発する色素
• TaqManプローブ：特異的なDNAにだけ反応する蛍光プローブ
• サーマルサイクラー（リアルタイムPCR装置）

RT-qPCRの用途まとめ

✅ 感染症検査（ウイルスRNAの検出）
✅ 遺伝子発現解析（mRNAの比較）
✅ miRNA解析、lncRNA解析など
✅ 治療効果・薬剤反応のモニタリング

RT-qPCRとqPCR、通常のPCRの違い

まとめ：RT-qPCRはRNAの“量”を測る技術！

🔹 RT-qPCRはRNA（特にmRNA）をリアルタイムで定量する方法
🔹 逆転写 → qPCRの2段階で行う
🔹 Ct値でRNA量の差を比較できる
🔹 感染症、がん研究、遺伝子発現解析に欠かせない

よくある質問（FAQ）

Q. RNAはそのままPCRできますか？
→ できません。必ずcDNAに変換（逆転写）してからPCRします。

Q. RNAの定量は何に使えるの？
→ 遺伝子の「発現量」がわかるため、病気の診断や治療効果の確認に使われます。

Q. qPCRとRT-qPCRの違いは？
→ 測定対象が違います。qPCRはDNA、RT-qPCRはRNA（をcDNAにして）を測ります。